（求助）关于ELISPOT..._链霉亲和素结合物_其他免疫产品_抗体类_知道

游客	收藏 \| 举报 2004-07-07 01:21 关注：227 回答：4 （求助）关于ELISPOT... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-05-22 04:17 （求助）关于ELISPOT

游客

举报 2004-07-16 16:59

ELISPOT（enzyme-linked Immunospot）采用定量夹心ELISA法，抗原特异性单抗预先包被在贴有PVDF的微孔板上，适量刺激后的细胞滴加入小孔中，并将微孔板放置于湿润37℃的二氧化碳温箱中孵育一段时间。在孵育的这段时间内，已固定的抗体（在紧靠分泌细胞的周围）与分泌出的被分析者结合。将未结合的物质和细胞洗涤掉之后，加入生物素标记的可与被分析者连接的多克隆抗体。洗涤掉未结合的生物素标记的抗体，加入连接有碱性磷酸酶的亲和素。洗去未结合的酶。假如底物（BCIP/NBT）在有相应细胞因子的位置有蓝黑色的小点，则每个小点代表一个分泌细胞，小点可用自动的ELISPOT阅读仪或用立体显微镜手工计数。

ELISPOT操作步骤概述无菌操作

在板条微孔内包被抗细胞因子的俘获抗体

用蛋白质结合空的细胞位点

在各孔内加入细胞并孵育

　
无需在无菌条件下操作

加入生物素标记的抗体

加入链霉亲和素酶

加入显色底物溶液

风干，避光保存

通过酶标仪或免疫印迹分析仪读出分析结果

游客

举报 2004-07-14 16:01

为什么选择ELISPOT?
ELISPOT斑点酶联免疫分析使细胞因子分泌过程更加形象。因为细胞因子围绕在细胞周围，在被上清液稀释之前，会和邻近细胞表面的受体结合，或者降解。细胞因子和GranzemyB ELISPOT实验是最有效的体外监控CD4或CD8T细胞抗原的方法。通过测定单个细胞因子信号及其频率，可以建立具有不同集落大小的特殊T细胞库。
ELISPOT实验检测细胞因子的独特优势
　☆从1到10，000，000，可以精确测量体外细胞因子的分泌频率，和ELISA以及四聚体染色、细胞内细胞因子染色相比，具有灵敏度高、特异性好的特点。提高灵敏度非常关键，因为体内产生抗原特异性T细胞的频率非常低。

☆大批量细胞分析：可以分析上百个样品，检测多种抗原。

☆所需细胞浓度低。和其他试验方法相比，ELISPOT方法对细胞浓度没有太高的要求，比如，检测600中不同的抗原或肽段只需要45ml血。

☆可以确定CD4或者CD8抗原决定簇。因为实验所需细胞量少，实验灵敏，所有ELISPOT对于决定簇图谱的绘制，肽段文库的筛选是最理想的选择。
☆可以建立抗原特异性T细胞亲和函数

☆可以研究未经药物处理过的T细胞的实际细胞因子分泌过程，T细胞分泌物下降，则说明T细胞产量减低或者单个细胞分泌功能下降。

☆ELISPOT不破坏淋巴细胞活性，可以继续进行细胞克隆以及低温储藏研究
☆低温存藏的人淋巴细胞可以继续保持生物学活性，可以重复实验步骤。

ELISPOT是现今研究T细胞功能，进行T细胞诊断最有力的工具，ELISPOT的研究已经成为一门科学。

ELISPOT分析仪专利草案
在病理学教授Paul V. Lehmann博士带领下，众多学者共同在CWRU大学通过了新一代ELISPOT分析仪的专利认证。最初ELISPOT是为了检测B细胞分泌抗体而问世的，因为T细胞分泌细胞因子而B细胞产生抗体，新一代的ELISPOT增加了检测T细胞分泌细胞因子的功能。

ELISPOT分析具有精确性、客观性，可重复性以及自动化特点，改变了以往ELISA的耗时，结果不客观的缺点。

ELISPOT分析仪的出现解决了以下问题
☆哪些斑点是抗原特异性T细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有T细胞研究价值）
☆斑点大小的意义
☆在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸

☆如何从单个细胞基础上分析

☆实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？

☆几次重复实验才能使结果更有意义？

ELISPOT：世界一流科学家辛勤劳动的果实

ELISPOT分析仪的最初研究在CWEU大学开始，由26名工作人员，15个科研工作者，和许多来自BD、Pharmingen的科学工作者共同努力下研制成功的，为此CTL也成为美国国立卫生院免疫耐受网络（ITN）指定的参考实验室，专门对各种ELISPOT临床试验结果进行测试。

经科学认证的ELISPOT分析仪包括三个分析模式，适用于客户不同的消费水平、研究目的、外围设备，附属软件和数据处理方法。另外，CTL提供图像分析服务，ELISPOT有自己的网上实验室，可以提供网络培训以及为临床试验项目按照合同约定提供研究服务。

EILISPOT：科学**

自从CTL发起ELISPOT**以来，很多人在借鉴我们的成功经验。作为创始人，CTL致力于开创ELISPOT新方法并将其提高到科学的高度。

游客

举报 2004-07-14 04:51

关于Elispot
随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或 CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及 CK 的水平。 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：

1. ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
2. ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过北京赛智创业生产的 ELISPOT 分析系统对斑点进行计数， 1 个斑点代表 1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）
3. 由于是单细胞水平检测， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从 20 万 -30 万细胞中检出 1 个分泌该蛋白的细胞。
4. 捕获抗体为 BD 、 R&D 、 Mabtech 、 Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

ELISPOT 检测原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过北京赛智创业科技公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

Elispot的出现解决了以下问题：

1. 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值）
2. 斑点大小的意义
3. 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸
4. 如何从单个细胞基础上分析
5. 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？
6. 几次重复实验才能使结果更有意义？

为什么要使用 ELISPOT ？

Elispot 分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。

使用 ELISPOT 的好处

1.Accurate ex vivo frequency measurements down to the one-in-one-million cell range. This resolution is orders of magnitude higher than that reached with intracellular cytokine or tetramer staining or by ELISA measurements (see Figure 1). Such added sensitivity is critical, since antigen-specific T cells typically occur in low frequencies in vivo.

2.High-throughput T cell analysis becomes feasible. A trained reference laboratory team can test hundreds of samples for reactivity to dozens of antigens.

3.Fewer cells are required compared to other cellular assays. For example, 45 ml of blood is sufficient for testing reactivity to 600 different antigens/peptides.

4.Determinants targeted by CD4 or CD8 cells can be defined. Because few cells are needed and the assay can be performed in high-throughput mode, ELISPOT assays are ideal for screening peptide libraries for determinant mapping.

5.The functional avidity of antigen specific T cells can be established. This is reflected by the 50% maximally stimulating peptide dose.

6.The actual secretory process of pharmacologically untreated cells can be studied. If decreased net production is seen, the distinction can be made as to whether fewer cells produce or there is reduced per cell productivity.

7.Lymphocytes survive the testing in ELISPOT assays. This permits post-assay propagation for further analysis, cloning, or cryopreservation.

8.Cryopreserved human lymphocytes can be tested without loss of function. Pre- and post-treatment samples can be tested side by side and results can be reproduced.

ELISPOT 技术应用领域

自身免疫检测、器官移植、疫苗和药品的研发与检测、 T 细胞功能研究、肿瘤研究、传染病的研究和检测、病毒研究等等。

目前 CTL 公司使用 ImmunoSpot 技术的部分研究领域

1. Single-Cell Resolution/Exact Frequency Measurements of Antigen-Specific T cells Ex Vivo.
2. Measuring Type 1/Type 2 Immunity
3. Cognate Cytokine Production by T Cells vs Bystander Cytokine Production
4. Measurements of Functional T Cell Avidity
5. Cytokine Co-Expression/Two Color ELISPOT
6. Spot Size Distribution
7. Determinant Mapping/High Throughput Screening
8. Assay to Assay Reproducibility of Ex Vivo Measurements on PBMC
9. Fresh vs. Cryopreserved human PBMC
10.CD8+ T cells and Granzyme B ELISPOT
11.ELISPOT With Cells Other than Human PBMC, or Murine Lymph Node/Spleen Cells
12.Vaccine and Adjuvants
13.Tumor Immunology
14.Transplantation Immunology

ELISPOT Assays Visualize the Secretory Product of Individual Cells
These assays are exceptionally sensitive as the product is captured directly around the secreting cell, before it is either diluted in the supernatant, captured by receptors of adjacent cells, or degraded.

Cytokine and Granzyme B ELISPOT assays have recently emerged as the most sensitive and robust technique for direct ex vivo monitoring of antigen-specific CD4 or CD8 T cells. By measuring the frequencies and cytokine signatures of individual cells, they establish the clonal size and effector class of the specific T cell pool.

游客	举报 2004-07-10 04:55 真是有用，建议版主加分

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