【求助】怎样筛选出稳转细胞株..._稳转细胞株_细胞株_细胞相关_知道

用荧光素酶基因标记肿瘤细胞步骤

哺乳动物生物发光，一般是将Firefly luciferase基因（由554个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。

我们采用慢病毒表达系统GFP（mCherry）和Luciferase2双标记表达细胞系，通过2A序列连接GFP（mCherry）和Luciferase2，可同时等量表达GFP（mCherry）和Luciferase2，便于体外观察和体内示踪；mCherry可用于体内示踪，与新一代Luciferase2结合，可方便的监测细胞在体内的生长和变化。

转染方法与标记过程的描述（慢病毒转染Hygromycin筛选）：

(一) 质粒部分

1.酶切载体：pGL4.10（luc2）由酶切获得1400bp的luc2基因片断；EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。

2.电泳和胶回收：上述酶切产物DNA电泳， TAKARA试剂盒胶回收，回收产物取少量电泳鉴定。

3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体，连接使用20ul体系，25℃，10min。

4.转化：感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入连接产物，静置25min后在水浴42℃，45sec热休克，后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h，将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。

5.挑取单克隆：观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中，255转摇菌6.5h。

6.小抽质粒与鉴定：使用碱裂解法小抽，质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。

7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下简称Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下简称Mluc）转染293T细胞：DNA定量后，使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染，试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水，其中一管加入1ug量的质粒（DNA体积=1ug/DNA浓度），轻轻震荡混匀，再轻微离心；在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀，轻微离心，然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中，室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内，37 ℃、5 % CO2条件下培养，8小时后换培养液。

8.报告基因检测：Passive Lysis Agent裂解细胞，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。

9.质粒中抽：取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜，使用Invitrogen试剂盒中抽，产物电泳鉴定，－20℃保存。

(二) 慢病毒包装部分

1. 质粒共转染细胞：转染前一天， 293T在10cm培养盘中的细胞达到90％，胰酶消化后，1：3传入新10cm培养盘中。转染时，细胞在培养盘中密度达到80％。采用脂质体PEI转染法使编码慢病毒包膜蛋白的质粒VSV G, Packaging Mix以及构建的Gluc或Mluc质粒15µg共转染。6h后换新鲜DMEM培养基。

2．提取病毒上清：转染48-72hours后，将含有病毒液的培养基转移到15ml离心管中,在低温4摄氏度条件下，3000rpm，离心10min去除片状沉淀的细胞碎片。

3．浓缩病毒：将病毒上清用0.45um滤器过滤至浓缩离心管中，2000rpm，4℃，15min离心。浓缩液收集于500µl离心管中，-80℃保存。

(三) 慢病毒感染&筛选

1.感染前一天(Day1)，消化目的细胞并计数，将细胞铺于24孔板中（以便在感染前细胞达到30%-50%的汇合度），37°C过夜孵化细胞。

2.(Day2) 解冻低温保存的慢病毒液，并且制备1：2病毒稀释液200µl加入细胞中。

3.向每孔加入Polybrene达到终浓度6ug/ml，晃匀孔板，37度孵化过夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培养基，加入500µl完全培养基。

5.(Day4)换液，加入300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

6.(Day4－7），每24h换液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）来选择稳定感染的细胞克隆。

维持培养。

7.(Day8－12）细胞逐渐由24孔板传入6孔板、6cm盘和10cm盘中100µg/ml Hygromycin维持培养。

8. 目的细胞-Gluc/Mluc细胞系鉴定: 取5×104细胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。GFP和mCherry表达通过荧光显微镜观察。