求助：质粒大抽后只有RNA一条带，RNA酶切后有三条很浅的带..._限制性内切酶_核酸酶类_分子类_知道

游客	收藏 \| 举报 2004-10-09 20:17 关注：211 回答：14 求助：质粒大抽后只有RNA一条带，RNA酶切后有三条很浅的带... 已解决悬赏分：0 - 解决时间 2024-05-16 16:34 求助：质粒大抽后只有RNA一条带，RNA酶切后有三条很浅的带，请教原因

游客	举报 2004-10-09 20:42 没看明白，把电泳图传上来看看。RNA应该与质粒相差很大一截子，怎么会只有RNA一条带呢？

游客	举报 2004-10-09 20:58 实验时取5ul跑的电泳，只有很粗的一条带，在最前端，很小。我没拍照片。用R酶处理后跑电泳，有三条很浅的带，证明是有质粒DNA的，可量太少了。能给个合理的解释吗？郁闷中~ 因需要量很大，做转基因（大动物）用。谢谢

游客	举报 2004-10-09 22:36 楼上大抽用什么试剂盒？ QIAGEN？

游客

举报 2004-10-10 18:45

我想可能是因为你大提时的操作有误，可以参考我大提时的方法，我觉得提出来的纯度比较高，而且比试剂盒提的多，我们用于动物转染时都有这种方法，你可以试一试，方法如下：质粒大提
操作步骤：
11.取单菌落接种到3mlLB培养液，37ºC振荡过夜（180r/min）培养至到OD600为0.6。
12.取出后放入250mlLB培养液中， 37ºC 180/min振荡培养12—16小时。
13.将细菌培养物倒人250ml大离心桶，冰浴10-15min后，(4000r/min),4ºC离心15mins,弃上清。倒置离心管使残液流净。
14.将菌体悬浮于100ml冰预冷的STE中，如步骤（3）离心收集菌体。
15.将收集的菌体用5ml溶液I悬浮。
16.加入10ml新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧离心管盖，温和地将离心管上下颠倒混匀5—7次
17.加入7.5ml冰冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀，冰浴放置10分钟，此时形成的白色沉淀
18.用4ºC 7000g离心裂解液15分钟,不踩刹车。
19.上清经高压的四层干酪纱布移入一洁净离心桶中，加入0.6倍体积的异丙醇（约10ml）充分混匀，室温放置30分钟进行沉淀。
20.室温下7000g离心15分钟。不踩刹车。
21.弃上清，用70％乙醇室温漂洗一次，7000g离心5分钟后弃上清，倒置，37ºC使乙醇挥发。质粒边缘透明即可。
22.加入1.5mlTE,PH8.0,溶解DNA沉淀。
PEG-8000纯化法
具体如下：
1.将1.5ml溶于TE中的质粒溶液移入两个EP离心管中，加入等V的 5mol/lLiCl（冰予冷）混匀，12000g,4ºC 离心10分钟。
2.移上清于另一离心管中，加入等量异丙醇混匀，室温2分钟后，12000g离心10分钟。
3.弃上清，70％乙醇洗沉淀，放置使乙醇挥发。
4.用TER 500ulPH 8.0，溶解沉淀，37ºC让RNA酶A消化RNA 30分钟。
5.加入等V的PEG-8000混匀后，4ºC过夜。
6.4ºC，12000g,离心。
7.取沉淀，用400ulTE溶解。
8.用水饱合酚抽提一次，酚：氯仿抽提一次，然后氯仿：异丙醇抽提一次。
9.上清移入ep管，加入0.1体积10mol/l醋酸铵，2倍体积的冷的无水乙醇混匀。放置-20ºC，几小时，12000g,4ºC离心10分钟。
10.弃上清倒置离心管，用70％乙醇漂洗，12000g,4ºC离心2分钟。
11.待乙醇挥发后(无菌时需在超净台里挥发)，用100ul高压水溶解。测OD260并计算质粒浓度。
12.分装DNA并保存于－20ºC。

游客	举报 2004-10-10 18:46 溶液I : 50 mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl (PH 8.0) 10mmol/L EDTA 溶液Ⅱ（新鲜配制） 0.2 mol/LNaOH 1% SDS 溶液Ⅲ 5mol/L KAc 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml

游客

举报 2004-10-10 19:34

我的操作步骤是：
1.取单菌落接种到10mlLB培养液，37ºC振荡过夜（180r/min）培养至到第二天上午8：00。
2.取出2.5ml放入250mlLB培养液中， 37ºC 220rpm振荡培养4小时（AM10~PM2）。
3.将细菌培养物倒人250ml大离心桶，8000rpm,18ºC离心10min,弃上清。倒置离心管使残液流净。
4.将菌体悬浮于10ml溶液I中。
5.加入20ml新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧离心管盖，温和地将离心管上下颠倒混匀6次,冰浴放置10分钟，此时溶液透明。
6. 加入7.5ml冰冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀（12次），冰浴放置10分钟，此时形成的白色沉淀。
7.用18ºC 12000rpm离心裂解液15分钟。
8. 上清移入一洁净离心桶中，加入2倍体积的无水乙醇（约90ml）充分混匀，室温轻摇3分钟进行沉淀。
9. 18ºC 12000g离心15分钟。
10.弃上清，倒置，室温使乙醇挥发。质粒边缘透明即可。
11. 加入8mlTE,PH8.0, 4ºC 溶解DNA沉淀。

溶液I 、Ⅱ、Ⅲ 相同

游客	举报 2004-10-11 08:54 我认为是这样的，大提时RNA特别多，电泳时EB都被RNA吸附了，所以看不见质粒DNA。而你消化RNA后能看见的条带就是质粒DNA了。提取质粒DNA时溶液Ⅲ用15 ml，乙醇沉淀时加盐。我觉得你最好在前面的操作中加入消化RNA的步骤。

游客

举报 2004-10-11 13:07

与楼上的意见一样：solutionIII应该用15ml这样才能把碱性裂解液的PH调回中性。
每一步离心时用8000rpm是不是太高了，这样破坏了菌体会使质粒溶入培基中而流失，用4度应该比较好。
在整个操作过程中你没有去RNA的过程，所以在电泳时你的RAN含量会很高。
你的这个步骤怎么看上去象是我做小提时的步骤，因为小提时的纯度不要求很高，但也加入了去蛋白的步骤，你连去蛋白的过程都没有，而且一些去除大分子物质及蛋白的过程一概没有。
你可以试试我的方法，虽然时间有些长，不过对于给动物进行转染，我觉得还是做得到位些比较好，这样可以看到你预期的结果，否则会严重影响你的转染效率。

游客

举报 2004-10-11 13:07

与楼上的意见一样：solutionIII应该用15ml这样才能把碱性裂解液的PH调回中性。
每一步离心时用8000rpm是不是太高了，这样破坏了菌体会使质粒溶入培基中而流失，用4度应该比较好。
在整个操作过程中你没有去RNA的过程，所以在电泳时你的RAN含量会很高。
你的这个步骤怎么看上去象是我做小提时的步骤，因为小提时的纯度不要求很高，但也加入了去蛋白的步骤，你连去蛋白的过程都没有，而且一些去除大分子物质及蛋白的过程一概没有。
你可以试试我的方法，虽然时间有些长，不过对于给动物进行转染，我觉得还是做得到位些比较好，这样可以看到你预期的结果，否则会严重影响你的转染效率。

游客	举报 2004-10-11 14:44 我现在所在的实验室据说都是这样做的，以前都有结果，也许还有什么我们没有考虑到？？？晕，我都不知道该怎么说，连异戊醇都不让用。

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