基因突变(点突变服务)

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更新: 2021-03-29
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提供商: 和元上海
服务名称: 和元生物基因突变(点突变服务)
规格: 按周期

人缺失BRCT结构域PES1过表达载体构建

摘要:和元以人cDNA为模板扩增PES1基因,通过搭桥PCR缺失BRCT结构域(Δ322–415)后替换慢病毒对照载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro中的EGFP。该载体骨架中3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达检测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达,来研究缺失BRCT结构域对PES1蛋白功能的影响。
关键词:PES1, BRCT, Δ322–415,过表达, 3FLAG, puromycin, lentivirus vector

一、 实验原理
PES1的BRCT结构域为第322-415氨基酸序列,研究缺失了这个BRCT结构域对蛋白功能的影响。PCR扩增PES1(Δ322–415)基因序列,构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体中CMV启动子后面的EcoR I和Xba I多克隆位点,目的基因代替了对照载体的EGFP基因。
pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下:


二、 实验目的
和元生物构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的人PES1(Δ322–415)过表达慢病毒载体

三、 实验方法
和元生物PCR扩增的PES1(Δ322–415)基因序列与经由EcoR I和Xba I酶切的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli DH5α感受态细胞。
菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下:
1. 引物设计:
从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列,用VectorNTI软件进行引物设计。PCR扩增目的基因:
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因,反应体系和条件如下:
 

 
2. 琼脂糖凝电泳检测PCR扩增结果:
目的基因PCR扩增成功后,进行琼脂糖凝电泳检测①,通过和DNA Maker的对比,判断目的基因是否扩增成功。
3. 胶回收目的基因片段:
把目的基因条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收,具体步骤步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备:
用限制性内切酶对表达载体的进行酶切,酶切反应体系为:质粒2μg,10 x反应Buffer 5μL,限制性内切酶各1μL,用水补足50μL,于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果,并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中:


6. 感受态细胞的制备和转化:
DH5α感受态细胞的制备和转化,详见《精编分子生物学实验指南》②
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子:
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中,取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下:

 
8. 阳性克隆送测序:
菌落鉴定得到的阳性克隆,送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提:
测序通过的阳性克隆,安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 和元实验结果
1. PCR扩增目的基因:
目的基因片段a的扩增:用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGGAGGCCTTGAGAAGAAG(含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列,并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因),反向引物GCTGCACCCCCTCCTGCGCCTCCAGCTCC(扩增目的基因1-322氨基酸序列,荧光标记的是重叠区域),对人cDNA进行扩增,预期PCR产物大小为999bp。
目的基因片段b的扩增:用正向引物  GGCGCAGGAGGGGGTGCAGCTGCCCCCACAC(扩增目的基因415-588氨基酸序列,荧光标记的是重叠区域),反向引物CCAGACGCGGTCTAGATCACTCCGGCCTTGCCTTCTTG(引物说明:含同源重组序列、Xba I酶切位点,并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因)对人cDNA进行扩增,预期PCR产物大小为552bp。
电泳结果如下:

 
                                                           

DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp

2. 表达载体的线性化
用EcoR I和Xba I对表达载体进行双酶切,得到810bp和6.9kb的片段,回收6.9kb的载体V。酶切图谱如下:

                                                                   
1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
用菌落PCR鉴定转化子,正向引物EPS1-SEQF   GGTCTTCCTGTCCATCAAAG位于目的基因序列中,反向引物WPRE-R CATAGCGTAAAAGGAGCAACA位于WPRE序列中,阳性克隆得到1039bp的片段。电泳结果如下:

                                
1. 阴性对照(H2O)
2. 阳性性对照(其他插入片段)
3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp
4~11   挑取的8个转化子
接种阳性克隆,保种并分装100μL送测序。测序没有问题的,再接种抽提质粒。

4. 测序结果分析
阳性克隆测序结果表明,和预期序列完全一致。按要求缺失了第322-415氨基酸序列的BRCT结构域。

                                   

            
五、 和元参考文献

1. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P57~58
2. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P25~26