细胞染色质免疫共沉淀（ChIP）试剂盒_PCR引物_PCR/RT-PCR/qPCR_生化试剂库_商城

货号：	WLA106a
保存条件：	-20℃及4℃
规格：	20T

产品名称：细胞染色质免疫共沉淀（ChIP）试剂盒
产品概述：染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）作为最佳的研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
包装信息:

试剂盒组分	WLA106a （20T）	保存条件
1M 甘氨酸	26ml	4°C
蛋白酶抑制剂	300μl	-20°C
Buffer A	20ml	4°C
Buffer B	10ml	4°C
Chip Diluiton Buffer	24ml	4°C
ProteinA beads	2.4ml	4°C
RNA Polymerase II抗体	40μl	-20°C
正常血清 IgG	40μl	-20°C
Low Salt Wash Buffer	20ml	4°C
High Salt Wash Buffer	20ml	4°C
LiCl Wash Buffer	20ml	4°C
TE Buffer	40ml	4°C
RNaseA	20μl	-20°C
Proteinase K	20μl	-20°C

注意事项：
1. 甲醛固定时，时间不宜过长，10min即可。
2. 超声时温度不能过高，最好冰浴进行；防止样品起沫。
3. 样品中加入填料后离心转数不能过大，防止填料破碎。
4. 蛋白酶抑制剂使用前室温融化。

操作流程：
1. 每皿细胞（9ml 培养液），加入243μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%，室温摇床10min。
2. 终止交联：加1M 甘氨酸1.26ml，使其终浓度为0.125M 室温摇床5min。
3. 吸尽培养基，用预冷的PBS洗两次后，加适量蛋白酶抑制剂（2ml PBS中加入5 蛋白酶抑制剂），用细胞刮收集细胞，2000rpm，4℃离心5min。
4. 弃上清，加入1ml Buffer A，冰上放置10min，3000-5000rpm离心5min。
5. 弃上清，加入400μlBuffer B（每100μlBuffer B中含有106细胞）重悬后加入5μl蛋白酶抑制剂。
6. 超声破碎。一般来说，300W超声10s，间隔30s，12次。12000rpm，4℃离心20min。取20μl 上清电泳检测，抹带集中在500-1000bp左右即可。
7. 样品分成三组，每组100 ，A：实验组 ; B：阳性对照组 ; C：阴性对照组，剩余样品可放置-80℃保存。
8. 在三组样品中分别加入900μlChip Diluiton Buffer。
9. 准备ProteinA beads，用1ml PBS 清洗三次（3000rpm离心1min）后保存备用，此步可提前准备。
10. 三组样品中各加入60μlProteinA beads， 4℃颠倒混匀1-2h。
11. 混匀后4℃静置10min，3000rpm离心1min。
12. 取上清，每组样品取20 进行nput实验，-20℃保存。
13. 实验组中加入1-10μg抗体；阳性对照组加入1μgRNA Polymerase II抗体；阴性对照组加入1μg正常血清IgG，4℃过夜孵育。
14. 三组样品中再加入60μlProteinA beads， 4℃颠倒混匀1-2h。
15. 洗涤ProteinA beads 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗步骤为：加入1ml 预冷溶液，在4℃混匀10min，3000rpm离心1min，除去上清。
a. Low Salt Wash Buffer，1次。
b. High Salt Wash Buffer，1次。
c. LiCl Wash Buffer，1次。
d. TE Buffer，2次。
16. 每管加入100μlElution Buffer（100μl10%SDS+100 1M NaHCO₃+800μldμldH₂O），室温颠转10min后3000rpm离心1min，收集上清。重复洗脱1次，终体积200μl。
17. 取出nput实验样品，室温融化后加入180μlElution Buffer。
18. 解交联。每管中加入8μl5M NaCl，混匀，65℃解交联过夜。
19. 解交联结束后，每管加入1μlRNaseA，37℃孵育1h。
20. 每管加入4μl0.5M EDTA，8μl1M Tris-HCl（PH=6.5），1μlProteinase K，45℃孵育2h。
21. DNA片段回收（WLA052a DNA凝胶回收试剂盒）。

温馨提示：不可用于临床治疗。

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