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份 库存999份
| 提供商： | 上海鸿立生物技术有限公司 |
| 服务名称： | RIP |
| 规格： | 一个细胞样本一个蛋白 |
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实验原理
使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞核蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质
复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物 洗脱后，通过质谱实验检测特定的lncRNA结合蛋白是否与lncRNA相互作用
试剂准备
cold lysis buffer：(胞质蛋白提取裂解液) RNA structure buffer：
1mM PMSF 10 mM Tris pH 7.0
20units Rnasin 0.1 M KCl
10mM Tris-HCl pH 7.4 10 mM MgCl2
10mM NaCl
3mM MgCl2
0.1mM DTT
0.5% NP40
RIP buffer:（胞核蛋白裂解液） nuclear isolation buffer（核提取液）：
150 mM KCl 1.28 M sucrose
25 mM Tris pH 7.4 40 mM Tris-HCl pH 7.5
0.5 mM DTT 20 mM MgCl2
0.5% NP40 4% Triton X-100
1 mM PMSF
protease Inhibitor
实验步骤
细胞数目：5X10^8 cells
胞浆蛋白的提取：
1、细胞消化下来预冷得PBS洗两遍，2000rpm离心4min。反复吹打收集细胞，转移到EP管，2000rpm，2min→弃上清，PBS 重复洗1次。
2、500µl cold lysis buffer重悬沉淀，冰浴10min。
3、5000rpm离心5min，4°C。上清为胞浆蛋白，沉淀为胞核部分。
4、将上清收集至另一EP管，500µl lysis buffer重悬沉淀，冰浴10min，5000rpm离心5min，4°C，弃沉淀，即得到胞核蛋白。
5、若需同时用胞浆及胞核蛋白，将二者等体积混合即可。
胞核蛋白的提取：
- 收细胞，PBS洗一遍。
- 2ml PBS+2ml nuclear isolation buffer+6ml 水重悬细胞，冰浴20min。
- 离心，2500g/4度/15 min，弃上清。
- 1ML RIP buffer（加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。
- 超声破碎细胞25个循环左右。
- 13000rpm离心10min，弃沉淀。
RNA Pull-down
- 体外转录标记lncRNA 探针（见附录），大约两小时（至浑浊）。
- DNase I处理15分钟。
- RNA纯化（RNeasy Mini Kit）。
- 3ug RNA，90度热击，2min。冰上，2min。
- 加入RNA structure buffer。
- 转入室温，20min。
- 将折叠好的RNA与蛋白混合，室温孵育1h。
- 每个样中加入60ul洗过的磁珠，室温孵育1h。
- 洗五次。
附：
探针标记：
(1) 2.5mM NTP Mix:
10mM GTP 20μl10mM UTP 20μl
10mM ATP 20μl
10mM CTP 12μl
10mM Bio-11-UTP8μl
- 体外转录反应
| Hot | Cold | |
| lineraized DNA (0.5μg/μl) | 2μl | 2μl |
| ddH2O | 6μl | 6μl |
| 5× buffer | 4μl | 4μl |
| NTP Mixs (2.5mM) | 4μl | - |
| RNAsin (40U/μl) | 1μl | 1μl |
| 100mM DTT | 2μl | 2μl |
| 10mM NTP Mix | - | 各 1μl |
| T7 pol (20U/μl) | 1μl | 1μl |
| 37℃，1hr | ||
- 探针纯化：
PN 200μl（10 倍体积）
上柱，12000rpm，30sec
PE 500μl
12000rpm，30sec→弃流出
PE 500μl
12000rpm，30sec→弃流出12000rpm，2min→弃流出
EB 50μl
12000rpm，2min→收集流出
通过嘉定区市场监管局认证 
