U87-GFP/mCherry-luc脑胶质瘤发光细胞株

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单价: 8000.00
品牌: sciencelight
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更新: 2021-07-26
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货号: u87-luc
生长状态: 良好
年限: 2年
运输方式: 顺丰快递
是否是肿瘤细胞:
物种来源:
相关疾病: 脑胶质瘤
供应商: 科远迪
数量: 10
  • 细胞名称   U87-GFP/mCherry-luc
  • 组织  脑胶质瘤细胞系
  • 母细胞来源  ATCC
  • 转染方法与标记过程的描述 慢病毒转染Hygromycin筛选 
  1. 质粒部分
1.酶切载体:pGL4.10(luc2)由酶切获得1400bp的luc2基因片断;EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段;pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。
 
2.电泳和胶回收:上述酶切产物DNA电泳, TAKARA试剂盒胶回收,回收产物取少量电泳鉴定。
 
3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体,连接使用20ul体系,25℃,10min。
 
4.转化:感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后,加入连接产物,静置25min后在水浴42℃,45sec热休克,后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h,将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。
 
5.挑取单克隆:观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中,255转摇菌6.5h。
 
6.小抽质粒与鉴定:使用碱裂解法小抽,质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解;酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。
 
7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2(以下简称Gluc)或pSin-hyg-mCherry/luc2(以下简称Mluc) 转染293T细胞:DNA定量后,使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染,试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水,其中一管加入1ug量的质粒(DNA体积=1ug/DNA浓度),轻轻震荡混匀,再轻微离心;在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀,轻微离心,然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中,室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内,37 ℃、5 % CO2条件下培养,8小时后换培养液。
 
8.报告基因检测:Passive Lysis Agent裂解细胞,加入荧光素酶作用底物,将转染质粒的细胞与阴性,阳性对照共同进行单报告基因检测。
 
9.质粒中抽:取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜,使用Invitrogen试剂盒中抽,产物电泳鉴定,-20℃保存。
 
  1. 慢病毒包装部分
1. 质粒共转染细胞:转染前一天, 293T在10cm培养盘中的细胞达到90%,胰酶消化后,1:3传入新10cm培养盘中。转染时,细胞在培养盘中密度达到80%。采用脂质体PEI转染法使编码慢病毒包膜蛋白的质粒VSV G, Packaging Mix以及构建的Gluc或Mluc质粒15µg共转染。6h后换新鲜DMEM培养基。
 
2.提取病毒上清:转染48-72hours后,将含有病毒液的培养基转移到15ml离心管中,在低温4摄氏度条件下,3000rpm,离心10min去除片状沉淀的细胞碎片。
 
3.浓缩病毒:将病毒上清用0.45um滤器过滤至浓缩离心管中,2000rpm,4℃,15min离心。浓缩液收集于500µl离心管中,-80℃保存。
 
  1. 慢病毒感染&筛选
1.感染前一天(Day1),消化U87细胞并计数,将细胞铺于24孔板中(以便在感染前细胞达到30%-50%的汇合度),37°C过夜孵化细胞。
2.(Day2) 解冻低温保存的慢病毒液,并且制备1:2病毒稀释液200µl加入细胞中。
3.向每孔加入Polybrene达到终浓度6ug/ml,晃匀孔板,37度孵化过夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培养基,加入500µl完全培养基。
5.(Day4)换液,加入300µg/ml  Hygromycin(Sigma)来选择稳定感染的细胞克隆。
6.(Day4-7),每24h换液,300µg/ml Hygromycin(Sigma)来选择稳定感染的细胞克隆。
维持培养。
7.(Day8-12)细胞逐渐由24孔板传入6孔板、6cm盘和10cm盘中100µg/ml Hygromycin维持培养。
8. U87-Gluc/Mluc细胞系鉴定: 取5×104细胞,用Passive Lysis裂解液裂解,加入荧光素酶作用底物,将转染质粒的细胞与阴性,阳性对照共同进行单报告基因检测。GFP和mCherry表达通过荧光显微镜观察。
  • 培养条件 :置于37℃、5%CO2培养箱中,用含10%胎牛血清(FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand)和1%双抗(100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml链霉素,Hyclone, Logan, UT, USA)的高糖DMEM培养基培养,培养三天(密度大概80%)按照1:3的比例传代。
【注意事项】用0.25-0.5%的胰酶(含有EDTA)消化3-5分钟,碧云天或sigma公司的都可以,碧云天的大概500元左右一瓶,500毫升,每次用1毫升。
  • 细胞传代所需时间:3天/代 
  • 筛选标记维持压力和选择压力:Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。