免疫荧光检测

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更新: 2021-06-01
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提供商: 上海百由生物
  • 石蜡切片免疫荧光实验步骤
  • 石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
  • 抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min,停火8min,转中低火7min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定)
  • BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织,室温封闭30min。
  • 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
  • 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,避光室温孵育50min。
  • DAPI复染细胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。
  • 封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
  • 镜检拍照:切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm;FITC绿光激发波长465-495nm,发射波长515-555 nm;CY3红光激发波长510-560,发射波长590nm)
  • 石蜡切片免疫荧光结果判读
    DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光