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质粒大提离心法试剂盒简明步骤（PD1511）
（详细内容请参考英文说明书）
I. 实验前准备 | II. 注意事项 |
RNase A: 使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。 | 质粒拷贝数：纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,C1,100%乙醇，相同体积的Wash Buffer (70% 乙醇)和Elution Buffer. 转化菌: 若为-70oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。 切勿直接取冻存在4oC的菌进行培养。 柱结合能力：1 mg 对富含内源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，请使用产品PD1713。 |
Buffer B1: 在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。 | |
Buffer C1: 在低于10oC会沉淀，请于37oC左右水浴加热至沉淀完全溶解。 准备70%和100%的乙醇。 | |
在室温下（22-25oC）进行所有离心操作。 | |
III. 操作步骤 | |
离心法:
1. 取100 µL新鲜的菌液接种到150-200 mL (勿超过 200 mL)的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
注：残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分，离心后沉淀较松，不能有效吸取上清。
注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（细菌密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，例如TB 或2×YT，请注意保证OD600不超过3.0。
2. 加入10 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
注：不完全悬浮易导致菌体裂解不完全，从而使产量降低。
3. 加入 10 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
注：切勿剧烈振荡。静置时间不应超过5分钟，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到破坏。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。
4. 加入2.8 mL Buffer C1, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
5. 将离心管转至高速离心机，在室温下14,000 g 离心20分钟（若离心后上清中有白色沉淀，可再次离心）。
注：低温下RNase不工作，易有RNA污染。如果离心机转子较冷，将离心管在室温下温育10min后再离心。
6. 小心吸取离心后的上清液至50 mL管中（避免吸起沉淀），加入9.2 mL Buffer C1和12 mL 100% 乙醇，立即混匀，混合液需马上过DNA柱。
7. 立即转移20 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下5,000 g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。将剩余溶液转移至DNA柱中，室温下5,000 g离心5分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复直至所有的溶液通过DNA柱。
注：如果50 mL的收集管与离心机转子不符，可在台式离心机 3,000 rpm 离心1分钟。
8. 向离心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室温下5,000 g 离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。可选步骤：重复步骤“8”。
9. 将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000 g开盖离心10分钟，以彻底去除残留的乙醇。
注：此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇，乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。
10. 将离心柱转至一个新的50 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL的ddH2O（pH在7.0-8.5之间）或Elution Buffer，室温放置1分钟，5,000 g 离心5分钟，以洗脱质粒DNA。
注：提取到的质粒DNA可直接用于基因克隆、测序、酶切、文库筛选、体外转录翻译、转染HEK293细胞。若用于转染内毒素敏感性细胞株，原代细胞及用于微注射，建议去除内毒素（PD1514）。
11. 可选步骤：若想提高得率，可用0.5 mL的ddH2O（pH在7.0-8.5之间）或Elution Buffer再洗脱一次，收集到新的50 mL离心管中。
IV. DNA浓度及纯度 |
DNA浓度(µg/mL) = OD260 x 50 x 稀释倍数.
OD260/ OD280约为1.7-1.9
V. 常见问题及解答 |
1、没有提出质粒或者质粒收获量很低
A、菌种老化：
ü 建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化。涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1：500的比例进行菌种培养。二次培养细胞最好不要超过16小时。
B、低拷贝质粒：
ü 建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量，如果必要，更换具有相同功能的高拷贝质粒载体。
C、质粒丢失
ü 建议：某些质粒在多次继代培养的过程中会出现丢失的现象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
D、裂解不充分
ü 建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。请根据选取的试剂盒，处理相应量的细菌量。
E、Buffer中有沉淀未溶解
ü 建议：Buffer B1和Buffer C1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如有沉淀生成，请置于50oC温育片刻，待溶液澄清后使用。
F、乙醇比例不对
ü 建议：按照说明书要求使用70%的乙醇洗脱，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。
G、离心柱中乙醇残留
ü 建议：漂洗后，可适当延长离心时间，已尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和超大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。
E、洗脱液加入位置不正确，
ü 建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。
F、洗脱液pH值不正确
ü 建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0~8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mMTris-HCl）进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0~8.5之间。
G、洗脱体积及时间的选择
ü 建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，可进行二次洗脱。
ü 建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2~5分钟，更有利于洗脱。
2、质粒纯度不高
A、蛋白质污染OD260/ OD280<1.7
ü 建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白质。
B、RNA污染OD260/ OD280>1.9
ü 建议：检查配送的RNase A是否完全加入到Buffer A1中，加入RNase A后，Buffer A1/RNase A应该存放在4oC，如果存放时间过长，或者没有正确存放，请重新加入RNase A。加入Buffer C1后应在室温下离心，RNase发挥作用。
C、基因组DNA污染
ü 建议：加入Buffer B1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入Buffer B1的处理时间最好不要超过5分钟。
3、加样时DNA飘出加样孔外
ü 建议：柱中残留乙醇未除净, 洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在硅胶膜
