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实时荧光定量PCR（Real-time PCR）
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| 荧光定量合同 |
实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）通过连续监测PCR指数扩增期间荧光信号的变化来即时测定 特异产物的含量，并据此推断目的基因的初始量。该方法可以检测细胞、组织或微生物中基因表达变化， 如不同药物浓度处理后相关基因表达水平高低变化等，与常规PCR（RT-PCR）相比，实时荧光 定量PCR具有极高的灵敏度、高度的重复性和极佳的特异性，且后续处理无EB等有害物质的污染，已成为现阶段国际公认的核酸分子定量检测的金标准，在基因表达研究和临床疾病检测等领域已得到广泛应用。服务需知：1、为保证实验的精确性，请客户在取样前与我们取得联系，我公司会派专人去协助取样；客户也可直接提供纯化好的总RNA/DNA（≥ 3 ug/ 样本）。2、请通过 E-mail 提供已知的全长基因序列或GeneBank号。 发送至：info@abigen.com 或QQ传输至：QQ：14928760833、希望提供详细的背景资料：生物物种信息（Human、Mouse、Rat等），DNA/ RNA来源、基因丰度等。荧光定量PCR操作流程（SYBR Green I 法）1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针。2、提取DNA/ RNA，紫外分光光度计检测其完整性和浓度，反转录酶将RNA反转录为cDNA。3、引物预实验，筛选出特异性最强的引物。4、荧光定量PCR，采用双标准曲线法，结合内参与目的基因的CT值，进行实验结果分析。5、实验完成后，提供完整的实验报告结果（含软件分析结果）及引物等相关实验材料。服务内容相对定量 (mRNA表达量分析)基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量法必须对样品的目的基因和内参基因同时分别进行定量，然后求出对于内参基因的目的基因的相对量。通过对样品间的目的基因的相对量进行比较，可以对不同样品间的mRNA进行表达量分析。内参基因通常选用表达量相对恒定的Housekeeping Gene，如：GAPDH、β-actin等。通过同时对内参基因的实时检测，可以对样品之间由于起始细胞数不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量误差进行校正，达到在严格意义上对样品之间的mRNA表达量进行分析之目的。绝对定量（构建标准品） 绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品，本公司服务内容为采用TA克隆的方法构建标准品。使用已知浓度的标准品制作5个点以上的标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量 (起始拷贝数)分析。 SYBR Green I 染料法(一般常用方法）SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加，荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。以SYBR Green I作为检测信号的荧光定量PCR方法称为染料法。TaqMan探针法（检测病毒使用，荧光标记引物，成本相对较高）PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。以Taqman探针作为检测信号的荧光定量PCR方法称为探针法。样品要求客户需提供组织、细胞、血液等样品材料，或纯化好的总RNA或总DNA，反转录好的cDNA样品，具
荧光定量PCR
| 服务编号 | 服务内容 | 服务价格 | 服务周期 | 注意事项 |
|---|---|---|---|---|
| RT-TJ | 相对定量SYBR GreenI PCR条件优化 | ￥800基因 | 10个工作日 | 需提供NCBI序列号，足量新鲜样品，提供3-5个样品，我们设计引物，摸索条件 |
| RT-SYBR | 相对定量SYBR GreenI 染料法---推荐方法 | ￥200/样品•基因 | 10个工作日 | 大多客户首选，需提供NCBI序列号，足量新鲜样品，我们免费设计引物和免费提供内参对照 |
| RT-TaqMan | 探针法荧光定量PCR样品检测 | 合成探针￥1200/条；样品检测￥160/样品•基因 | 15个工作日 | 需提供引物序列，标记等，需验证引物合格，样品保证新鲜 |
| RT-TA | 绝对定量TA克隆制备标准品 | ￥900/基因 | 20个工作日 | 提供材料和NCBI号 |
Real-time PCR具体实验流（以细胞为例）一．总RNA提取用Trizol法(ABIzol)1．用预冷的无菌PBS洗细胞3次，尽可能吸尽PBS，每培养瓶（细胞总数约为5×106个）加入1ml Trizol。用枪吹打细胞，然后装入预冷的EP管中，室温放置5分钟。2．以0.2ml/ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，待充分乳化溶液呈乳白状，室温放置2～3分钟。3．4℃12000xg离心15min。离心后溶液分为三层，由下至上为：淡粉的酚仿层、中间白色蛋白层和澄清的水相，RNA在水相中，约为500µl。4.取上层水相于一新的离心管，按0.5ml /ml Trizol的比例加入异丙醇，室温放置20分钟。5．4℃12000g离心10分钟。RNA沉淀后呈胶状片层。6．弃上清，按1ml /ml Trizol液加入75%乙醇（DEPC水配制）。7．轻轻上下翻转，4℃ 7500xg离心5分钟。8．小心弃上清，室温干燥3～5分钟。9．将RNA溶于30-50ul（根据RNA的量而定）DEPC水中。10．RNA样品长期保存于-80℃冰箱。
二．RNA反转录成cDNA（以ABIGEN M-MLV反转录酶为例）：RNA 3µl Oligo(dT) 1µl 5XBuffer 5µldNTP(10mM) 5µlRibonuclease inhibitor 0.5µlM-MLV RT 1µldd H2O（DEPC处理） 9.5µl______________________ 25µl体系以上42℃孵育60分钟，然后70℃ 10分钟, 然后迅速放在冰上。三．PCR1．RT-PCR体系：cDNA 2µl引物1(10pmol/µl) 1µl引物2(10pmol/µl) 1µlBuffer(10X) 2.5µlTaq 0.5µldNTP(10mM) 2µdd H2O 16µl_____________________ 25µl2．Real-time PCR体系：cDNA 2µl引物1(10uM) 1µl引物2(10uM) 1µl2xSYBR mix 10µldd H2O 6µl________ 20µl
