点击图片查看原图
microRNA 测序结果分析
背景和实验介绍
Small non-coding RNA是生物体中非翻译的并且具有重要调控作用的一类RNA，现已发现的这类RNA包括siRNA, microRNA, rasiRNA, piRNA等。过去的十几年中，small non-coding RNA的调控作用一直是生物学的研究热点.基因芯片技术（比如Exiqon公司的LNA microRNA芯片）可以准确定量已知小RNA的表达谱，新一代测序技术（比如Illumina公司的Solexa测序技术）不仅可以定量已知小RNA的表达量，也可以发现并且定量未知的小RNA，测序技术也可以检测群体内部或者病变个体的单核苷酸突变位点。
一个典型的样本制作以及测序流程如下图所示：
Fig.1 测序的流程图。a)提取所有的RNA；b)RNA跑电泳，不同大小的RNA处于不同的条带位置，选择特定大小的RNA进行后续处理；c)基于不同的接头序列库进行反转录和扩增；d)电泳选择合适长度的DNA；e)在测序仪上进行测序。 数据处理流程图：
Fig.2 数据处理流程图数据分析项目
我们公司提供详尽的后续分析服务，包括生物学应用以及专业统计处理，条目如下：
一．测序质量分析
即可以mapping到基因组的reads数占总共reads数的百分比，reads长度的直方图分析，reads峰值分析等等。
Fig.3 小RNA序列长度分布图。测序的结果定位在基因组上，直方图显示各个序列长度在总序列长度中的分配情况，如图所示，两批样本显示出不同的长度峰值，a样本在21nt和24nt各有一个峰值，且主要集中在24nt上，b样本在19nt和24nt各有一个峰值，且主要集中在19nt上。
二．测序结果在annotation中的分布情况分析
将mapping到基因组的序列进行定位，按照已有注释信息进行归类，划分为不同的类别，并且计算占各个类别的百分比，绘制百分比分布图。
Fig.4 小RNA在基因组上的分布饼图。A图显示这些小RNA在基因注释库中的分布，包括基因、重复序列、非转录RNA和基因间区，图示大部分序列来自未注释区域和microRNA区域；B图显示小RNA的上下文注释情况，图示多数小RNA的上下游都来自内含子区域和基因间区。
三．定量已知小RNA的表达量
对于microRNA可以基于个体或者转录组进行准确定量，对于piRNA可以进行基于位置的cluster定量。
四．计算不同样本差异表达的小RNA
基本于不同试验设计我们选择不同的统计检验，得出差异表达的小RNA以及相应的fold change value, odds ratio, P value等等，并且制作heatmap图。
Fig.5 microRNA表达量的聚类热图。依据miRNA在9个样本中的表达量变化情况，可以清楚的将其分为两类，一类在处理前高表达，一类在处理后高表达，这些处于相同类别的miRNA可能参与了相同或者相似的生物调控网络。
五．预测新的microRNA
测序技术可以得到一些未知转录本的信息，基于序列信息以及表达谱信息，我们可以用已知软件如miRDeep或者Mirpred进行新microRNA的预测。
六．靶基因的预测
对于新的microRNA，我们提供可能靶基因的预测服务，为后续实验提供参考。
七，调控网络构建
针对表达差异microRNA 构建microRNA 与靶基因，microRNA与疾病网络调控图等。
参考文献
A Ribeiro-dos-Santos, et al. (2010) Ultra-deep sequencing reveals the microRNA expression pattern of the human stomach. PLoS ONE 5(10): e13205. doi:10.1371/journal.pone.0013205.
B Wang, et al. (2010) Survey of the transcriptome of Aspergillus oryzae via massively parallel mRNA sequencing. Nucleic Acids Res. 38(15):5075-87.
VM Bruno, et al. (2010) Comprehensive annotation of the transcriptome of the human fungal pathogen Candida albicans using RNA-seq. Genome Res. 20:1451-1458.
Ahn H W, et al. (2010) MicroRNA transcriptome in the newborn mouse ovaries determined by massive parallel sequencing Mol. Hum. Reprod. 16:463-471。
S Montameny，et al. (2010) Next Generation Sequencing of miRNAs – Strategies, Resources and Methods. Genes. 1:70-84.
G Zhang, et al. (2010) Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome. Genome Res. 20:646-654.
T Watanabe, et al. (2007) Gene Expression Signature and the Prediction of Ulcerative Colitis–Associated Colorectal Cancer by DNA Microarray. Clin Cancer Res. 15:415-420.
S Volinia，et al. (2010) Reprogramming of miRNA networks in cancer and leukemia. Genome Res. 20:589-599.
