L-半乳糖苷-1,4-内酯脱氢酶测定试剂盒 微量法

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更新: 2020-10-25
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产品内容

提取液:液体110mL×1瓶,4保存。

试剂一:粉剂×1瓶(棕色),-20避光保存。临用前加入16mL蒸馏水,充分溶解。

试剂二:粉剂×1瓶,4避光保存。临用前加入2mL蒸馏水,充分溶解。

产品说明:

L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜,负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步,也是该途径的关键酶之一,对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。

Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原氧化型细胞色素cCyt c),还原型Cyt c550nm有吸收峰;测定还原型Cyt c增加速率,来计算Gal LDH活性。

自备仪器和用品:

台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、粗酶液提取:

称取约0.1g样品,加提取液1mL,冰上充分研磨,13000g 4离心10min,取上清液置冰上待测。

二、Gal LDH测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到550nm,蒸馏水调零。

2. 按样本数取出一定量的试剂一在37水浴锅中预热30 min以上,其余的分装保存(-20)

3. 空白管:依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水160μL预热的试剂一和20μL试剂二、,迅速混匀后于550nm比色,记录10s130s的吸光值。

4. 测定管:依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的试剂一和20μL试剂二,迅速混匀后于550nm比色,记录10s130s的吸光值。

三、Gal LDH活性计算:

a.使用微量比色皿测定的计算公式如下

Gal LDH活性单位定义:37中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c1U

1)按蛋白浓度计算

Gal LDHU/mg prot=[(A测定管-A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V)÷T

=0.289×(A测定管-A空白管) ÷Cpr

2)按样本鲜重计算

 

Gal LDHU/g 鲜重)=[(A测定管-A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V÷V样总×W)÷T

=0.289×(A测定管-A空白管) ÷W

     ε:还原型Cyt c摩尔消光系数,17.3×103L/mol/cmd:比色皿光径(cm)1cmV反总:反应体系总体积,0.2mL=0.0002L1061mol=1×106μmolV样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mLV样总:提取液体积,1 mLCpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W:样品质量,gT:反应时间,2min

b.使用96孔板测定的计算公式如下

Gal LDH活性单位定义:37中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c 1U

1)按蛋白浓度计算

Gal LDH (U/mg prot) = [(A测定管-A空白管)÷(ε×d)×V反总×106Cpr×V样)÷T

=0.482×(A测定管-A空白管) ÷Cpr

2)按样本鲜重计算

Gal LDH (U/g 鲜重) = [(A测定管-A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V÷V样总×W)÷T

=0.482×(A测定管-A空白管) ÷W

     ε:还原型Cyt c摩尔消光系数,17.3×103L/ mol/cmd96孔板光径(cm)0.6cmV反总:反应体系总体积,0.2mL=0.0002 L1061mol=1×106μmolV样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mLV样总:提取液体积,1 mLCpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W:样品质量,gT:反应时间,2min

注意事项: 

注意事项:

1、在测定酶活时要注意温度。建议取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃水浴锅中,在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2、建议两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

3、加入最后一种试剂后需迅速混匀并测定OD值。