TALEN技术制备基因敲除小鼠(大鼠)

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更新: 2021-04-17
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一、技术原理         TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技术是基于对DNA识别域 (TALEN 结合臂) 和人工改造的核酸内切酶的切割域(FokⅠ)的结合对细胞基因组进行修饰而实现的。TALEN的DNA识别域是由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成,每个模块由34个氨基酸组成,其中第12和13位的氨基酸种类为可变的(RVDs),且决定了该模块识别靶向位点的特异性。通过DNA识别域结合到靶位点上,以及FokI的切割域形成二聚体后,可特异性对目标基因DNA实现切断,在非同源末端连接修复过程中,DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。 该技术目前已成功应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类模式动物的研究领域。 二、技术特点:         1、可以应用于大小鼠;无动物品系限制,永久失活;        2、成功率可达90%以上;        3、实验周期短、价格低 。 三、制备流程及服务周期         设计、构建Talen质粒(2周)→TALEN质粒体外转录成mRAN(1周)→mRAN原核显微注射(F0代鼠生产) (4周)→F1代鼠生产(12周)四、服务承诺         赛业生物科技承诺提供4只F1代大鼠。五、TALEN 技术流程图          TALEN由四部分组成:N端序列,RVD,C端序列,FokI。利用Type II限制性内切酶可以将RVDs模块分别生成不同的粘性末端,同时又不留有酶切位点, 通过一系列的相应酶切连接反应实现RVDs与TALEN骨架的无缝连接。        TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。FokI形成二聚体发挥活性,在TALEN结合臂的引导下,发挥特异性内切酶活性,在两个靶位点之间剪切DNA,形成DSB(Double-Strand Breaks),诱发DNA损伤修复机制。细胞通过NHEJ(Non- homologous End Joining)修复DNA,在此修饰过程中导致删除或插入了一定数目(非3的倍数)的碱基,造成移码,形成对目标基因特异性KO的突变体。  六、Cygen 利用TALEN技术成功构建 IgM KO Rat 案例:

SD Rat IgM Knockout(TALEN)

T TCCTGCCCAGCTCCAT ttccttctcctggaact  ACCAGAACAACACTGA  ATAL1 RVDs:NG HD HD NG NN HD HD HD NI NN HD NG HD HD NI NG TAL2 RVDs:NG HD NI NN NG NN NG NG NN NG NG HD NG NN NN NG  

结果:Sequencing confirmation of disruption of  the Rat IgM by TALEN

突变型1、突变型2、野生型结果说明: 突变型1: 缺失12 bp;突变型2: 缺失5 bp。