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| 货号： | DL101-01 |
| 规格： | 100rxn |
Dual Luciferase Reporter Assay Kit
- 使用萤火虫萤光素酶及海肾荧光素酶双萤光对照，结果更可靠
- 适用于多种真核细胞，细胞裂解液可离心分离冻存使用或直接在孔板中检测，节省平板和操作时间，细胞裂解产物可稳定保存室温8小时，或4℃7天，或-20℃三个月以上。
- 萤光强度高，持久性强，萤火虫萤光素及海肾萤光素光强1分钟内衰减小于10%，5分钟内衰减小于30%。
- 线性范围达7个数量级，适用于强/弱启动子或高/低水平表达调控的检测
使用前注意事项
1. 首次使用时将Reaction Buffer II (Luciferase)全部倒入含有冻干底物的Luciferase Substrate棕色避光瓶中，充分混匀后按使用需求分装并避光保存于-80℃；
2. 每次使用前以1:4的比例将5 ×Cell Lysis Buffer与ddH2O充分混合，置于冰上备用；
3. Renilla Substrate溶解于乙醇中，首次使用时请短暂离心，小心量取管内溶液体积，如发现液体体积有明显减少，请加入乙醇补足体积后保存；
4. 使用时将Renilla Substrate于冰上暂存，计算实际使用量，以50:1的比例将适量的Stop & Reaction Buffer和Renilla Substrate混匀，室温避光备用；
5. 酶促反应对温度较为敏感，因此加样检测前需将细胞裂解产品和检测底物液均平衡至室温后使用；
6. 检测仪器选择：能够检测化学发光的仪器都适用于本试剂盒的检测，但针对相同样品，不同检测仪器的本底信号值和测量值均可能不同，因此需在预实验中检测仅加入萤光底物的本底信号，且对于同一样本的检测，不同仪器的数值不可横向比较。若使用全波长酶标仪进行检测，为防止孔间干扰，推荐使用不透明酶标板，且检测孔间有一定间隔。
实验步骤：
1. 细胞裂解
吸弃细胞培养基，用PBS洗涤两次，按下表建议加入适量1 ×Cell Lysis Buffer，室温静置或振摇裂解5分钟，吹打并吸取细胞裂解产物至1.5 ml离心管中，12000 g常温离心2分钟，取上清用于后续检测。或在细胞培养板中直接加入底物检测。
| Cell Culture Plate | Volumn of 1×Cell Lysis Buffer |
| 6-well | 500 µl |
| 12-well | 200 µl |
| 24-well | 100 µl |
| 48-well | 50 µl |
| 96-well | 20 µl |
注：如果萤光素酶的表达水平过低，可适当减少裂解液的使用量以提高蛋白浓度。
2. Firefly luciferase反应检测
将100 µl平衡至室温的Luciferase Substrate加入检测管或酶标板中，小心吸取20 µl细胞裂解上清至检测管或酶标板孔中，迅速混匀后立即于荧光检测仪(Luninometer)或酶标仪中检测Firefly luciferase报告基因活性。
3. Renilla luciferase反应检测
在以上反应液中加入100 µl 新鲜配制的Renilla 底物工作液，迅速混匀后立即于荧光检测仪或酶标仪中检测Renilla luciferase报告基因活性。
Dual Luciferase Reporter Assay Kit用于通过报告质粒转染细胞后检测Luciferin底物萤光强度以反映Luciferase表达量的方法，检测基因调控作用。先以萤光素（Luciferin）为底物检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)，后以腔肠素（Coelenterazine)为底物检测海肾萤光素酶（Renilla luciferase),同时抑制Firefly luciferase的催化反应，实现双萤光素酶报告基因检测。Dual Luciferase Reporter Assay Kit可灵敏高效地检测受基因元件调控的Luciferase表达，通常将转录调控元件克隆于Firefly luciferase的上游，或把3‘UTR调控区克隆于Firefly luciferase下游，转染细胞后进行相应的刺激物诱导，裂解细胞并测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性评价调控元件受刺激物诱导的作用强弱。Renilla luciferase作用为校正转染效率的内参，以消除孔间细胞数量和转染效率的差异。Firefly luciferase催化Luciferin发光波长为560 nm，Renilla luciferase催化Coelenterazine发光波长为465 nm。
[VIP第1年] 指数:2
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