【求助】PCR疑难求解！问题很复杂，我已经摸索1个多月了，未果。。。。

equitech-bio

楼主 | 收藏 | 举报 2009-07-30 22:34 浏览: 247 回复: 12

最近一个月真是快疯掉了，啥结果都没有，历经煎熬啊，体系和温度都被我翻了个底朝天，可依然没有头绪，目的条带死也不出来，丁香园里的热心人帮我解解吧，想死的心都有了。
上游引物：CCGGAATTCCTAGCTGCTCTTACAG
下游引物：CGGCTCGAGTACAGCAGAATACTCAG
P人的目的基因，前10个是保护碱基+酶切位点。引物TM值是63.5，65度。
之前怀疑是引物的问题，让公司重新免费合成了一对，还是出不了结果。下面是我的摸索过程：
1. 我拿到引物后，首先以低TM值减5度为中心温度开始摸梯度，即58度，如附件1所示。1道为DL2000，2-9道温度分别是54.5，55.2，56.2，57.4，58.6，59.8，60.8，61.5.看到前三道有smear。
2. 因此把温度下降到52.5度为中心梯度继续摸索，结果如图2所示。2-9道温度分别为49，49.7，50.7，51.9，53.1，54.3，55.3，56.结果看到2-8道均有smear，且5道即温度53度的smear较集中于我的目的条带位置（472bp），当时好开心，以为结果就快出来了。
3. 把温度梯度范围继续缩小，以51度为中心梯度，继续P。结果如图3所示。2-9道温度分别为48.5，49，49.7，50.6，51.4，52.2，53，53.5.全部都有smear,但第8及第9道仍可隐约看见smear中心接近目的条带位置。当时很失望，以为这次就能出结果的，因为之前的片段这样稍微摸索一下就出了很漂亮的目的带。
4. 温度摸到这一份上，觉得应该不是温度的问题了，于是我开始调整体系。之前用过此体系P内参，条带都很好，一直以为这是一个成熟的体系的。但凡事都有万一，我决定一试。首先调整酶的浓度，我的酶是MBI的普通taq酶，1U/L，25UL体系是用2.5UL;,于是我从2.5开始递减0.2直到1.5UL，结果啥都没有，除了引物二聚体。
5. 我想应该不是酶的问题，又把酶的浓度定回到2.5UL，开始调整镁离子的浓度，这是跟酶配套的镁离子，从2.5UL开始递减到1.5UL.结果也是啥都没有。
实验做到这里，我真的找不出原因了，请各位大侠也好，路过的也好，指点指点吧！看看这个思路对不对？还有哪里没想到的？接下来要怎样去做？

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楼主 | 收藏 | 举报 2009-07-30 22:34 浏览: 247 回复: 12

最近一个月真是快疯掉了，啥结果都没有，历经煎熬啊，体系和温度都被我翻了个底朝天，可依然没有头绪，目的条带死也不出来，丁香园里的热心人帮我解解吧，想死的心都有了。
上游引物：CCGGAATTCCTAGCTGCTCTTACAG
下游引物：CGGCTCGAGTACAGCAGAATACTCAG
P人的目的基因，前10个是保护碱基+酶切位点。引物TM值是63.5，65度。
之前怀疑是引物的问题，让公司重新免费合成了一对，还是出不了结果。下面是我的摸索过程：
1. 我拿到引物后，首先以低TM值减5度为中心温度开始摸梯度，即58度，如附件1所示。1道为DL2000，2-9道温度分别是54.5，55.2，56.2，57.4，58.6，59.8，60.8，61.5.看到前三道有smear。
2. 因此把温度下降到52.5度为中心梯度继续摸索，结果如图2所示。2-9道温度分别为49，49.7，50.7，51.9，53.1，54.3，55.3，56.结果看到2-8道均有smear，且5道即温度53度的smear较集中于我的目的条带位置（472bp），当时好开心，以为结果就快出来了。
3. 把温度梯度范围继续缩小，以51度为中心梯度，继续P。结果如图3所示。2-9道温度分别为48.5，49，49.7，50.6，51.4，52.2，53，53.5.全部都有smear,但第8及第9道仍可隐约看见smear中心接近目的条带位置。当时很失望，以为这次就能出结果的，因为之前的片段这样稍微摸索一下就出了很漂亮的目的带。
4. 温度摸到这一份上，觉得应该不是温度的问题了，于是我开始调整体系。之前用过此体系P内参，条带都很好，一直以为这是一个成熟的体系的。但凡事都有万一，我决定一试。首先调整酶的浓度，我的酶是MBI的普通taq酶，1U/L，25UL体系是用2.5UL;,于是我从2.5开始递减0.2直到1.5UL，结果啥都没有，除了引物二聚体。
5. 我想应该不是酶的问题，又把酶的浓度定回到2.5UL，开始调整镁离子的浓度，这是跟酶配套的镁离子，从2.5UL开始递减到1.5UL.结果也是啥都没有。
实验做到这里，我真的找不出原因了，请各位大侠也好，路过的也好，指点指点吧！看看这个思路对不对？还有哪里没想到的？接下来要怎样去做？