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wb 小分子蛋白 cleaved caspase-1 12kd，il-1β 17kd一直跑不出来急求！！

楼主  收藏   举报   帖子创建时间:  2017-11-03 19:59 回复：22 关注量：149

求园子大神帮忙看看哪里出问题：

本人做炎性小题相关课题，最近跑小分子蛋白 cleaved caspase-1 12kd，il-1β 17kd一直跑不出，曝光时无条带。

条件如下：

本人收上清 用millipore 3kd 超滤管离心 3000g 50min,BCA 测得蛋白浓度在1点几mg/ml左右。

跑胶条件 ：上样量：20ug

                电泳 浓缩胶80v 30min，分离胶 100v 70min

                转膜：300mA 100min 0.22um的膜

                封闭：5%牛奶 1h 室温

                洗：1X TBST 5min 3次

                一抗：1：1000 4度摇床 过夜

               洗：1X TBST 5min 3次

               二抗：1:5000 牛奶稀释的 室温 1h 摇床

               显色

求各位大神赐教！！！

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  2. 评论

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  • chao_yw 2017-11-04 18:19
    #1

    il-1β抗体综述：

    https://www.labome.com/review/gene/human/IL-1beta-antibody.html

    caspase-1抗体综述（并不是全是cleaved的）：

    https://www.labome.com/review/gene/human/caspase-1-antibody.html

    你可以看下上面两个综述中的相应sci中的实验条件和结果，最好的话你用自己手头的抗体货号在www.labome.com直接查，直接看这个抗体别人的报道结果

  • agustinsun 2017-11-06 19:39
    #2

    chao_yw

    il-1β抗体综述：

    https://www.labome.com/review/gene/human/IL-1beta-antibody.html

    caspase-1抗体综述（并不是全是cleaved的）：

    https://www.labome.com/review/gene/human/caspase-1-antibody.html

    你可以看下上面两个综述中的相应sci中的实验条件和结果，最好的话你用自己手头的抗体货号在www.labome.com直接查，直接看这个抗体别人的报道结果

    好的 谢谢~ 但是有些具体的细节文献中不是很详细

  • 沐晴儿HQG7 2017-11-14 08:57
    #3

    在嘛，我最近也在跑IL-1β,IL-6,TNF-α也是不出，求指教，用的都是CST的抗体，电泳70V，70分，电转320mA,1h，室温5%牛奶封闭1h，TBST洗3次，一抗封闭1:1000 4℃过夜

  • 铜钱草草 2017-11-15 19:43
    #4

    转膜时间有调整过吗？适当缩短一下试试。我15kd的蛋白转膜20~45min均可以。还有一抗的浓度有调整过吗？有的时候说明书推荐的可能比较稀。

  • zsj153 2017-11-20 16:51
    #5

    我最近也在做小分子蛋白，17/25KD，我觉得转膜时间有点过了吧，可以适当缩短，100v转30min。

  • dxy_qzikq8q4 2017-11-22 15:35
    #6

    封闭之后不要洗，直接敷一抗！

  • 天王盖地虎-0 2017-11-29 19:59
    #7

    沐晴儿HQG7
    在嘛，我最近也在跑IL-1β,IL-6,TNF-α也是不出，求指教，用的都是CST的抗体，电泳70V，70分，电转320mA,1h，室温5%牛奶封闭1h，TBST洗3次，一抗封闭1:1000 4℃过夜

    分泌性蛋白，转膜条件200mA 40mins 差不多  这些蛋白有pro和mature，尽量保留比较宽的分子量范围   ，提高上样量和抗体浓度 试试看

  • agustinsun 2017-12-07 12:38
    #8

    铜钱草草

    转膜时间有调整过吗？适当缩短一下试试。我15kd的蛋白转膜20~45min均可以。还有一抗的浓度有调整过吗？有的时候说明书推荐的可能比较稀。


    好的我试试缩短下时间。我现在用的是1:500推荐的事1:1000

  • agustinsun 2017-12-07 12:39
    #9

    zsj153

    我最近也在做小分子蛋白，17/25KD，我觉得转膜时间有点过了吧，可以适当缩短，100v转30min。


    转膜后染了丽春红是有条带的

  • yousiring 2017-12-27 11:15
    #10

    沐晴儿HQG7
    在嘛，我最近也在跑IL-1β,IL-6,TNF-α也是不出，求指教，用的都是CST的抗体，电泳70V，70分，电转320mA,1h，室温5%牛奶封闭1h，TBST洗3次，一抗封闭1:1000 4℃过夜

    你好，请问你现在有跑出来吗？使用的条件是什么呢

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