点击图片查看原图
产品内容：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体3.5 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体3.5 mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体30 mL×1瓶，4℃保存；
标准品：液体1mL×1支，20μmol/mL丙***酸钠标准品，4℃保存。
产品说明：
GPT（EC 2.6.1.2）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化氨基酸和***酸转氨基反应，在氨基酸代谢中具有重要作用。此外，哺乳动物肝细胞GPT活性很高，当肝细胞坏死，GPT释放到血液中，血清GPT活性显著增高。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
GPT催化丙氨酸和α-***戊二酸发生转氨基反应，生成丙***酸和谷氨酸；加入2,4-二*****肼溶液，不仅终止上述反应，而且与***酸中的羰基加成，生成丙***酸***腙；***腙在碱性条件下呈红棕色，可以在505nm读取吸光值并计算酶活力。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样品测定的准备
1、细胞或微生物样品的制备：
先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。3500g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：
称取约0.1g组织，加入1mL提取液进冰浴行匀浆。3500g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
二、测定操作表：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。
2、 标准曲线的测定
首先将标准品稀释至2μmol/mL，按下表混合标准品和试剂一得到浓度梯度标准管：
标准品（μL）
试剂一（μL）
标准管浓度（μmol/mL）
22.5
7.5
1.5
15
15
1
12
18
0.8
6
24
0.4
3
27
0.2
1.5
28.5
0.1
0.75
29.25
0.05
0
30
0
3、 在EP管中加入下列试剂
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | ||||||
待测样本 | 5 |
|
| ||||||
试剂一 | 25 | 25 |
| ||||||
标准液 |
|
| 30 | ||||||
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热30min | |||||||||
试剂二 | 25 | 25 | 25 | ||||||
待测样本 |
| 5 |
| ||||||
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min | |||||||||
试剂三 | 240 | 240 | 240 | ||||||
混匀，室温放置10min，在505nm波长处测各管吸光度。 | |||||||||
注:0μmol/mL 标准管为空白管。
三、计算
1、 标准曲线的绘制：
以各标准溶液浓度为x轴，以∆A（A标准管-A空白管）为y轴做标准曲线，得到方程y=kx+b。将（A测定管-A对照管）带入方程求x值。
2、 GPT活性计算：
（1）按样本鲜重计算：
单位定义：每小时每g样品催化产生1μmol丙***酸的量为一个GPT活力单位。
GPT（U/g鲜重）=x×（V样本+V试剂一）÷（W×V样本÷V样总）÷T=12x÷W。
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生1μmol丙***酸的量为一个GPT活力单位。
GPT（U/g prot）=x×（V样本+V试剂一）÷（Cpr×V样本）÷T=12x÷Cpr。
（3）按血清体积计算：
单位定义：每小时每mL血清样品催化产生1μmol丙***酸的量为一个GPT活力单位。
GPT（U/g鲜重）=x×（V样本+V试剂一）÷V样本÷T=12x。
（4）按细胞或细菌数量计算：
单位定义：每小时每104个细胞或细菌催化产生1μmol丙***酸的量为一个GPT活力单位。
GPT（U/104 cell）=x×（V样本+V试剂一）÷（500×V样本÷V样总）÷T=0.024x。
V样本：样本体积，0.005mL；V试剂一：试剂一体积，0.025mL；V样总：提取液体积，1mL；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，0.5h；500：细胞或细菌总数，万。
